问答题微量碱法分离纯化质粒DNA的原理及其主要步骤。

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微量碱法分离纯化质粒DNA的原理及其主要步骤。

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第1题：

用柱层析法纯化质粒DNA时DNA的何种残基与硅基质结合（）

A、嘌呤
B、磷酸盐残基
C、嘧啶
D、糖基
E、氢离子

正确答案:B

第2题：

寡聚dT-纤维素柱层析用于（）

A、从总DNA中分离纯化质粒DNA
B、从总核蛋白中分离DNP
C、除去杂蛋白
D、从总RNA中纯化mRNA

正确答案:D

第3题：

脉冲电场凝胶电泳主要用于

A、细菌基因分型

B、测序前的产物纯化

C、超螺旋大质粒的分离

D、SNP位点的检测

E、小片段DNA的梯度分析

参考答案：AC

第4题：

简述质粒DNA的分离提取方法。

正确答案: （1）选择性抽提法，（2）碱性SDS法

第5题：

试回答蛋白质串联亲和纯化分离原理、方法及步骤。

正确答案: 串联亲和纯化（TAP），用于研究蛋白质在生理条件下的相互作用，通过嵌入一段蛋白质标记，在目的蛋白的一端或中部导入蛋白质标记，这样便在没有破坏目的蛋白调控序列的基础上，使得被标记的目标蛋白其表达量与其在细胞中自然表达水平相当，避免了由于过量表达的导致非自然条件下的蛋白质相互作用。经过特异性的两步亲和纯化，在生理条件下与目标蛋白发生真实作用的蛋白便可被一起洗脱下来，这样得到的蛋白质复合体接着可以用质谱技术或Edman降解法进行鉴定。
方法及步骤：
（1）蛋白质标记：由蛋白A的IgG结合区（ProtA）和钙调蛋白结合区（CBP）构成，中间被一个TEV蛋白酶的酶切位点隔开；
（2）构建表达标记蛋白的细胞或组织：将编码蛋白质标记的基因片段导入目标蛋白质编码基因的特定部位；
（3）细胞抽提物的准备；
（4）串联亲和纯化；
（5）蛋白质复合体的鉴定。

第6题：

从细菌中分离质粒DNA的方法都包括的基本步骤是（）。

A、培养细菌检测质粒
B、培养细菌使质粒扩增
C、收集和裂解细胞
D、分离和纯化质粒DNA
E、B+C+D

正确答案:E

第7题：

简述生物活性物质分离纯化的主要原理。

正确答案: 生物大分子分离纯化的主要原理是：
1）根据分子形状和大小不同进行分离，如差速离心与超离心、膜分离、凝胶过滤等；
2）根据分子电离性质（带电性）差异进行分离，如离子交换法、电泳法、等电聚焦法；
3）根据分子极性大小及溶解度不同进行分离，如溶剂提取法、逆流分配法、分配层析法、盐析法、等电点沉淀及有机溶剂分级沉淀等；
4）根据物质吸附性质的不同进行分离，如选择性吸附与吸附层析等；
5）根据配体特异性进行分离，如亲和层析法等

第8题：

简述生物活性物质分离纯化方法的主要原理。

正确答案:一是得用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配到可用机械方法分离的两个或几个物相中，如盐析，有机溶剂提取，层析和结晶等；二是将混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于来同区域而达到分离目的，如电泳，超速离心，超滤等。

第9题：

分离纯化的主要操作步骤。

正确答案:细胞分离（离心、传统过滤和膜过滤。）；细胞破碎和碎片分离（均质法和高速玻璃珠研磨法，离心法和双水相提取法）；浓缩（超滤-----错流系统）；色谱分离

第10题：

小批量碱变性提取质粒DNA的原理与基本过程如何？

正确答案: 碱变性法是常用的质粒抽提方法，其原理是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH值高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的NaAc高盐缓冲液去调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质－SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
小批量碱变性提取质粒DNA的基本过程为——
（1）酶或机械法等方法破坏细胞，释放出胞内物质；
（2）加碱使DNA与蛋白质变性，加中和液复性。因为质粒DNA分子量小易复性，从而使得其与基因组DNA分离；
（3）在上清液中通过酚－氯仿抽提、去垢剂或酶使剩余蛋白质变性或水解，除去蛋白质；
（4）再加入醇溶液使质粒DNA变性沉淀而与其他水溶性物质分离；
（5）将沉淀溶解于有RNase的TE溶液中，温育降解RNA后电泳检测、-20℃保存。

微量碱法分离纯化质粒DNA的原理及其主要步骤。

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